Structure de l’ADN
L’ADN possède une structure en double brin formant une double hélice. Chaque brin est orienté de 5’ vers 3’, ce qui indique le sens de lecture de la molécule. Cette orientation est cruciale lors de la synthèse d’ADN et de la conception d’amorces pour la PCR.
Contrairement à une idée répandue, seulement 1‑2 % du génome humain code des protéines ; le reste est non‑codant. Ainsi, l’affirmation selon laquelle l’ADN contiendrait environ 98 % de séquences codantes est fausse.
Lorsqu’on compare l’ADN double brin et simple brin, on observe que le double brin forme la double hélice grâce à l’appariement A‑T et C‑G, tandis que le simple brin apparaît après la dénaturation, lorsqu’il est séparé en deux chaînes individuelles.
Principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction)
La PCR est une technique qui permet d’amplifier un fragment d’ADN d’intérêt, obtenant ainsi une grande quantité de matériel génétique à partir d’une petite quantité initiale. Cette amplification est rendue possible grâce à un cycle répété de trois étapes distinctes.
Les trois étapes d’un cycle PCR
- Dénaturation : à 95 °C, les deux brins d’ADN sont séparés pendant environ 30 s.
- Hybridation (ou annealing) : les amorces se fixent à une température d’annealing (Ta) qui dépend du Tm de chaque amorce. Cette température n’est pas fixe pour toutes les amorces.
- Élongation : la polymérase synthétise le nouveau brin à 72 °C.
Le Tm (température de fusion) correspond à la température où 50 % des bases sont non appariées, et non à 100 % comme une idée fausse le suggère. Pour chaque amorce, un Tm compris entre 50 °C et 60 °C est recommandé, avec un ΔTm entre les deux amorces inférieur à 5 °C. Des Tm très différents entre les amorces compromettent l’efficacité de l’hybridation.
Évolution de la quantité d’ADN cible
Au cours des cycles, la quantité d’ADN cible augmente de façon exponentielle : chaque cycle double la quantité d’ADN présent. Après environ 30‑35 cycles, la réaction atteint une phase de saturation due à l’épuisement des réactifs et à la diminution de l’activité de la polymérase. Au-delà de 40 cycles, il n’y a plus d’augmentation significative.
Applications de la PCR
La PCR permet de détecter des agents pathogènes tels que la toxoplasmose. Elle est également utilisée pour le diagnostic de maladies génétiques : par exemple, la mucoviscidose est détectée en ciblant une mutation du gène CFTR, tandis que le VIH est détecté en amplifiant l’ARN viral.
En génétique légale, les empreintes génétiques utilisent des microsatellites, de courts motifs répétés, pour identifier des individus. Les VNTR (Variable Number Tandem Repeats) analysent le nombre de répétitions d’un locus, et non seulement la séquence exacte, ce qui les différencie des microsatellites.
Migration de l’ADN sur gel d’agarose
L’ADN possède une charge négative qui le fait migrer vers l’anode lors d’une électrophorèse. La vitesse de migration dépend de la taille du fragment : les fragments plus courts se déplacent plus rapidement que les fragments plus grands. Ainsi, l’affirmation selon laquelle les fragments d’ADN plus grands migrent plus rapidement est fausse.
Résumé des points clés
- L’ADN est une double hélice orientée de 5’ vers 3’.
- Seul 1‑2 % du génome humain code des protéines.
- La PCR amplifie l’ADN en trois étapes : dénaturation (95 °C), hybridation (Ta variable) et élongation (72 °C).
- Le Tm correspond à 50 % de désappariement des bases ; il doit être compris entre 50 °C et 60 °C pour chaque amorce.
- ΔTm entre les amorces doit être < 5 °C.
- L’amplification est exponentielle jusqu’à la saturation (30‑35 cycles).
- La PCR détecte des agents comme la toxoplasmose, la mucoviscidose (mutation CFTR) et le VIH (ARN viral).
- Les microsatellites et les VNTR sont des marqueurs génétiques utilisés en identification.
- Sur gel d’agarose, la migration dépend de la taille du fragment, les plus petits se déplaçant plus vite.
